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细胞克隆形成实验,你做对了吗?

“克隆”顾名思义,即体细胞无性繁殖,1个细胞分裂成2个细胞,进行种群繁殖并扩大的过程,通过克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状,是体外测定细胞增殖能力的一?#27542;?#29992;技术。这项实验虽然操作简单,却有很多同学在最终拍照时很难拿到好看的图片,不得不一次又一次重复实验,今天我们就看看如何规范的做克隆形成实验。

克隆形成的目的

1. 评价不同杀伤因素(药物、基因等)对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性;

2. 评价细胞在体内成瘤性,癌细胞不一定都可以在体内成瘤,但若体外克隆能力越强,即表明体内成瘤性越强,算是一种模拟体内成瘤的体外实验。

克隆形成实验步骤

a.接种:取对数期生长的细胞以500-1000个/孔的密度接种于6孔板(接种时注意梯度稀释细胞悬液,观察细胞密度,以免因计数不准确导致实验结果偏差),每个实验组设3个复孔,培养基为含30%FBS的完全培养基;

b.于细胞培养箱?#20449;?#20859;7-14天左右,每隔3天进行换液并观察细胞状态,显微镜下观察克隆大小(3复孔之间克隆大小应相似),待单个克隆生长到大小不超过图片?#21491;?#26102;可以进行拍照(如下图左)

c.固定染色:移除培养基,PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定细胞20 min;移除多聚甲醛,用0.2%结晶紫染色5min;用水洗涤细胞,晾干,扫描拍照;(如下图右)

d.计数

注意!注意!注意!高能预警

细胞密度为多少合适?

细胞接种密度与最终实验结果密切相关,若细胞太多,形成克隆数目太多,很难拍到单独的克隆团。而细胞太少,可能无法形成克隆,从而影响对该细胞增殖能力的判?#31232;?#19968;般来说,正常增殖速度为1:5-1:10传代,3天长满细胞,可以接种500个细胞,其余增殖缓慢细胞,可以接种800-1000。

细胞接种后培养的时间,如何确定?

通常情况下,单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆,时间约为一周;但具体时间因细胞增殖能力而已异,因此应密切关注细胞生长情况,隔天在显微镜下观察克隆情况,若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。

细胞铺板均匀的重要性

若铺板不均匀,细胞稀的地方形成的克隆少,而密的地方克隆多,一方面影响统计结果,并且拍出的图片不美观。

细胞未形成克隆的原因?

并非每种细胞都可以形成克隆,克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度,加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长,应给细胞多加培养基,如每孔4ml,或者3天更换一?#38395;?#20859;基,以供给细胞充足的营养。

以上为本次为大家介绍的细胞克隆形成的实验方法,它们的操作过程很简单,但是我们会遇到很多小问题,导致最终结果不理想,切记,控制接种密度,铺板均匀是2大关键点,多多练习摸索,一定会有好数据和图片哦!

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